Dopo il primo esame gli ovociti vengono messi in coltura in un apposito liquido e poi incubati per almeno 3 ore in una macchina che mantiene costante la temperatura (circa 37 gradi), l'umidità e altri parametri.

Nel frattempo l'uomo deve produrre tramite masturbazione un campione di liquido seminale. Per l'uomo è un momento stressante, e talvolta l'ansia è tale da non riuscire a eseguire il prelievo. Per eliminare i rischi di questa reazione emotiva alcuni centri fanno consegnare un campione di seme qualche giorno prima del pick-up, in modo da congelarlo e tenerlo da parte per ogni evenienza. Se non è stata presa questa precauzione e il prelievo non riesce, l'unica soluzione è fare il pick-up e tentare di congelare gli ovociti, rinviando la fecondazione a un altro momento. Nei casi di azoospermia è possibile recuperare gli spermatozoi direttamente dai testicoli tramite un intervento chirurgico.

Una volta ottenuto il campione, il liquido seminale viene esaminato per controllarne la qualità e per prepararlo alla fecondazione. La preparazione può variare a seconda della qualità degli spermatozoi; se il seme è di pessima qualità servono procedure più complesse per recuperare una quantità di spermatozoi mobili e morfologicamente normali sufficienti a fecondare gli ovociti.

E' in questa fase che si decide se fare una FIVET o una ICSI: nel primo caso ovociti e spermatozoi vengono messi a contatto nel liquido di coltura e si lascia che "facciano tutto da soli"; nel secondo caso si inietta uno spermatozoo in ciascun ovocita .Di solito l'indicazione a fare una ICSI anziché una FIVET è emersa già prima in base delle varie analisi diagnostiche, ma spesso la decisione di optare per la ICSI è presa all'ultimo momento a seconda della qualità degli spermatozoi e della quantità di ovociti recuperati.

Quanto al numero di ovociti da fecondare la scelta dipende da vari fattori, inclusi eventuali obblighi di legge.In alcuni Paesi la legge impone dei limiti al numero di embrioni che si possono produrre, e questo comporta fecondare solo un certo numero di ovociti; se ad esempio non si possono creare più di 3 embrioni, bisognerà fecondare al massimo 3 ovociti – con il rischio però di ottenere solo 1-2 embrioni da trasferire (o nessuno!) perché le percentuali di fecondazione non è mai il 100%: nelle donne più giovani la percentuale può essere dell'80%, ma in media è del 60% e, nelle donne meno giovani, può non superare il 30%. Se non ci sono limiti imposti dalla legge si possono fecondare tutti gli ovociti disponibili per poi valutare, in base al numero di embrioni che si sono prodotti, quanti possono essere trasferiti subito in utero e quanti sono da congelare.

Dopo essere stati fecondati gli ovociti vengono rimessi in coltura per alcune ore. Il controllo dell'avvenuta fecondazione avviene infatti 16-20 ore dopo l'incontro dei due gameti: se c'è stata la fecondazione dentro l'ovocita sono visibili i due pronuclei femminile e maschile, che contengono rispettivamente il patrimonio genetico della donna e dell'uomo. A questo punto non si parla più di ovocita ma di zigote.

La foto qui a sinistra mostra un ovocita fecondato, cioè uno zigote, come appare il giorno dopo la fecondazione: i due circoletti al centro sono i pronuclei, che contengono il DNA maschile e femminile, mentre la corona che circonda l'ovocita è la zona pellucida.

Se c'è solo il pronucleo femminile significa che non c'è stata fecondazione, mentre se ce ne sono tre significa che la fecondazione è avvenuta in modo anomalo. La foto qui a destra mostra appunto uno zigote triploide, cioè che contiene 3 pronuclei anziché 2 (dunque contiene 69 cromosomi anziché 46). Poiché si tratta di anomalie genetiche incompatibili con lo sviluppo di un embrione vitale, questi zigoti non saranno trasferiti nell'utero.

Gli zigoti si sviluppano secondo un percorso ben preciso. Anzitutto i due pronuclei si fondono in un unico nucleo che conterrà 46 cromosomi, 23 da parte della donna e 23 da parte dell'uomo; poi la nuova cellula comincia a dividersi con un ritmo intenso, che la porta in pochi giorni a superare il centinaio di cellule:

• circa 48 ore dopo la fecondazione, cioè il 2° giorno dopo il pick-up, l'embrione è formato da almeno 4 cellule.
• circa 72 ore dopo la fecondazione, cioè il 3° giorno dopo il pick-up, l'embrione è formato da almeno 8 cellule; in questa fase lo zigote si chiama morula (in latino "piccola mora") perché è formato da un gruppo di cellule che somigliano a una mora
• al 4° giorno dopo la fecondazione l'embrione raggiunge lo stadio chiamato morula compatta: è formato da 16-32 cellule che si uniscono molto strettamente e al suo interno inizia a formarsi una cavità piena di liquido, chiamata cavità blastocistica
• al 5° giorno dopo la fecondazione l'embrione diventa una blastocisti: le sue cellule, 32-64, smettono di essere totipotenti e iniziano a dividersi in uno strato esterno, che formerà la placenta, e in uno strato interno, dal quale si svilupperà l'embrione vero e proprio
• al 6°-7° giorno dopo la fecondazione la blastocisti inizia a impiantarsi nell'utero; non è un evento istantaneo ma un processo complesso che si concluderà circa 14 giorni dopo la fecondazione: a quel punto la gravidanza sarà iniziata